Các kỹ thuật sinh học phân tử

1. TÁCH CHIẾT VÀ ĐIỆN DI ADN

1.1. Tách chiết ADN

Ở tế bào Eukaryota, phần ADN đa số nằm vào nhân tế bào, trên các NST, vị vậy trước nhất cần biểu hiện ADN thoát ra khỏi màng nhân, ra khỏi tế bào. Dưới đây là các bước chủ yếu hèn của quy trình:

- bước 1: giải tỏa ADN ra khỏi màng tế bào bằng phương pháp nghiền, sử dụng áp suất, rất âm hoặc dùng phương thức hóa học hoặc dùng cách thức sinh học tập (dùng enzym). Sau đó, lếu dịch được ly vai trung phong để vứt bỏ chủ yếu các mảnh vụn của tế bào.

Bạn đang xem: Các kỹ thuật sinh học phân tử

- bước 2: bóc bỏ phần protein vào tế bào, trong NST. Proteinase K thường xuyên được dùng. Ly trọng tâm để loại bỏ phần tủa của proteinase K (tủa bởi phenol, chloroform).

- cách 3: kết tủa ADN (thường sử dụng Ethanol). ADN tủa được để khô ở ánh nắng mặt trời phòng và mang đến tan trong đệm TE (Tris, EDTA) cùng giữ ngơi nghỉ nhiệt độ: - 40 C. Để bảo vệ lâu dài, dung dịch ADN được bảo quản ở -200C mang đến -800C.

1.2. Tách bóc chiết ARN

Phương pháp bóc chiết ARN toàn phần cũng bao hàm các bước cơ bản như so với ADN:

- giải phóng ADN và ARN thoát khỏi màng tế bào.

- tách bóc loại cho chỗ protein.

- Tủa acid nucleic.

Bước tiếp theo: dịch chiết chứa acid nucleic được ủ với ADNase để phân bỏ ADN, tiếp đến hòa tung dịch chiết đựng ARN vào nước; tủa bởi ethanol, nhằm thu được ARN toàn phần. MARN rất có thể được tách riêng. Dựa vào kết cấu phân tử mARN có đuôi poly A bao gồm thể bóc mARN bằng sắc cam kết ái lực trên cột oligo T - cellulose. Bây giờ đã thực hiện bộ kit (bộ mẫu thử chuyên dụng) sử dụng những viên bi từ gồm mang oligo T trên bề mặt. Thông qua liên kết bổ sung A = T những mARN bám lên bề mặt các viên bi từ; kế tiếp bằng chuyên môn ly trọng tâm thu lại những viên bi và tách bóc mARN. Kỹ thuật này đến phép tách bóc giữ lại mARN với khối lượng rất nhỏ.

Chú ý: trong quy trình thao tác, né lẫn ADN, ARN của đối tượng người dùng khác vào dụng cụ. Tránh những enzym tàn phá ADN hoặc ARN cần nghiên cứu, đặc trưng ARN không bền dễ bị phân ly do ARNase. Sau khi tách bóc chiết ADN, kiểm tra độ trong sáng của ADN bằng khẳng định tỷ lệ OD260/OD280 cùng CD260/CD280 =1,7-2 được xem như là sạch hoặc bằng phương pháp điện di ADN (xem phần thực tập).

1.3. Điện di ADN

Acid nucleic là những đại phân tử tích năng lượng điện âm, trong điện trường tất cả điện vắt và cường độ tương thích ADN, ARN di chuyển từ rất âm mang lại cực dương.

Để kiểm tra và khẳng định tính hóa học của ADN, nên điện di ADN bên trên thạch (gel). Phân tử ADN càng nhỏ càng di động nhanh. Tùy theo form size của phân tử ADN mà bạn ta dùng những loại gel không giống nhau:

- Phân tử ADN có dưới 500 song Nu sử dụng polyacrylamid gel

- Phân tử ADN bao gồm dưới 500 - 10.000 Nu cần sử dụng Agarose gel

- Phân tử ADN có tương đối nhiều đôi Nu hơn cần sử dụng Agarose gel gồm lỗ to hơn (Pulsed field agarose gel).

Để quan giáp hình hình ảnh ADN khi điện di, người ta nhuộm ADN bằng ethidium bromide, dưới tia nắng tử ngoại, ADN gắn với ethidium bromide sẽ phát sáng.

Khi đến chạy năng lượng điện di ADN phân tích thường tất cả ADN mẫu (Marker) thuộc chạy để so sánh, khẳng định số lượng Nu của đoạn ADN.

Phương pháp điện di ADN còn được dùng để kiểm tra kết quả tách bóc chiết ADN.

2. PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (polymerase chain reaction: PCR)

Phương pháp này được Mullis và cùng sự lời khuyên vào năm 1985.

Mục đích phương pháp: vạc hiện với nhân đoạn ADN nhiều lần vào ống nghiệm.

Để thực hiện được phương thức cần có: phân tử ADN ban đầu, nhị đoạn ADN mồi (primers), mỗi mồi gồm khoảng tầm 20 base, hai

mồi này thêm ở nhị đầu của phân tử ADN ban đầu: mồi ngược và mồi xuôi. 4 loại Nu (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), Taq polymerase: enzym polymerase gồm tính chịu ánh nắng mặt trời cao; enzym này được bóc tách chiết từ loài vi trùng Thermus aquaticus.

Phương pháp PCR tiến hành qua nhiều chu kỳ, mồi chu kỳ luân hồi gồm 3 giai đoạn:

- giai đoạn biến tính: ủ ADN ban sơ ở ánh nắng mặt trời cao: 92 - 950C để tách bóc ADN thành tua đơn.

- tiến độ lai ghép: ADN mồi được lai ghép với sợi 1-1 của ADN ban đầu. Thực hiện ở nhiệt độ độ: 50 - 520C.

- quy trình tiến độ tổng thích hợp ADN: Taq polymerase tinh chỉnh sự gắn tiếp những Nu vào sau ADN mồi dựa ADN ban sơ làm khuôn. Tiến hành ở nhiệt độ: 70 - 720C. Sau từng chu kỳ, từ một phân tử ADN thuở đầu tổng hợp yêu cầu hai phân tử ADN, đến chu kỳ luân hồi sau nhị phân tử đó lại làm khuôn để tổng hợp bắt buộc 4 phân tử ADN.

.Qua những giai đoạn như sẽ nêu sinh hoạt trên, cùng cứ như vậy thực hiện tiếp các chu kỳ sau. Sau 30 chu kỳ từ 1 phân tử ADN ban đầu sẽ có 230 phân tử được tạo thành thành

Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhậy, xuất phát từ một lượng ADN vô cùng ít ban đầu, với cặp mồi tương ứng, đặc hiệu, sau thời điểm áp dụng phương thức PCR sẽ sở hữu một lượng bự ADN đủ sử dụng cho rất nhiều chẩn đoán, nghiên cứu. Phương pháp PCR trong nhiều trường hợp đã sửa chữa thay thế cho phương pháp Southern blotting vì cách thức này tiến hành nhanh, cần lượng ADN ít.

Từ phương pháp PCR ban đầu, thời buổi này người ta đã khuyến cáo nhiều cải biến chuyển để cải thiện tính năng của phương pháp.

- PCR lồng (Nested PCR): trong nghệ thuật này cần sử dụng hai cặp mồi, gồm trình tự những Nu lồng sát vào nhau (có nghĩa rằng cặp mồi máy hai có trình tự những Nu bên trong cặp mồi lắp thêm nhất). Đoạn ADN được tổng hợp vày cặp mồi đầu tiên được sử dụng làm khuôn mẫu cho PCR lần máy 2. Điều này sẽ làm tăng cường độ đặc hiệu của làm phản ứng PCR. Nó chỉ nhân lên đoạn đặc hiệu của ADN lần 1, đôi khi nó sẽ không nhân lên cùng với những thành phầm không đặc hiệu của lần 1.

- Nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang: QF - PCR (quantitative - fluorescense - polymerase chain reaction): năm 1993, Manfield lần trước tiên ứng dụng phương thức nhân đoạn ADN định lượng huỳnh quang đãng - từ năm 1998 đến nay một trong những phòng nghiên cứu đã thực hiện thành công chuyên môn này trong chẩn dự đoán sinh hội triệu chứng Down. Ví dụ: dựa vào kết quả định lượng gen DSCR1 (gen được xác định ở vùng 21q21.1 - q 22.2 tương quan đến dị tật tim và chậm cải tiến và phát triển tâm thần của hội chứng Down), để xác minh thai bị Down hoặc không.

3. XÁC ĐỊNH TRÌNH tự NUCLEOTID trong PHÂN TỬ ADN (Sequencing)

Về nguyên lý người ta rất có thể xác định trình tự các Nu vào cả bộ gen (genome) nhưng lại trong đk hiện nay, người ta bắt đầu chỉ xác định trình trường đoản cú Nu ở đa số đoạn ADN xác định.

Sau đấy là hai cách thức đã được áp dụng để thực hiện khẳng định trình từ bỏ Nu: phương thức hóa học và phương pháp enzym học, vào đó phương thức enzym học tập được ứng dụng nhiều.

3.1. Phương pháp enzym học (phương pháp Sanger)

Nguyên lý của phương pháp này là dùng các dideoxyribonucleotid để tránh đính thêm thêm các Nu tiếp theo. Phương pháp gồm các bước:

- cách 1: Phân tử cần xác minh trình tự những Nu được dùng làm khuôn nhằm tổng thích hợp nên một vài đoạn ADN cùng ban đầu ở 1 vị trí giống nhau nhưng xong ở địa chỉ khác nhau. Phản ứng tổng hợp có ADN polymerase xúc tác in vitro.

Trong 4 ống thử có các thành phần như thể nhau là sợi ADN khuôn, 4 các loại Nu (dATP, dCTP, dGPT, dTTP). Đánh lốt phóng xạ 32P cho 1 loại dideoxyribonucleotid lấy ví dụ như ddATP. Sự không giống nhau là ở vị trí trong từng ống sẽ bổ sung cập nhật thêm moi một số loại dideoxyribonucleotid không giống nhau.

Ví dụ ống 1 đến ddATP, ống 2 đến ddGTP, ống 3 cho ddCTP cùng ống 4 mang đến ddTTP.

- cách 2: trong quá trình tổng hợp sử dụng dideoxyribonucleotid là Nu bị mất team OH ở phần thứ 3 nên khi nó được đã nhập vào chuỗi ADN thì không tồn tại sự thêm thêm Nu nữa. Hiện tượng này sẽ tạo ra một thang gồm các đoạn ADN tất cả chiều dài khác nhau, hiện rõ khi năng lượng điện di.

- cách 3: để khẳng định được địa chỉ của tất cả 4 nhiều loại Nu phải có sự phối kết hợp hình hình ảnh điện di của cả 4 ống biểu thị trên 4 làn với những băng khác biệt mà vị trí của từng băng đặc trưng cho địa điểm từng Nu và đọc cũng theo vật dụng tự từ bên dưới lên. Toàn bộ các băng được đọc bằng phương thức tự chụp hình phóng xạ hoặc lưu lại huỳnh quang.

3.2. Phương pháp hóa học tập (phương pháp Maxam cùng Gilbert)

Nguyên lý của phương thức là cần sử dụng hóa hóa học liều không nhiều để tàn phá một trong bốn loại Nu khiến cho chuỗi ADN.

Các bước của cách thức như sau:

- cách 1: tách ADN sợi kép thành sợi đơn, mang đến sợi solo tiếp xúc với chất hóa học để tàn phá một trong tư loại base (ví dụ A). Vì chỉ cách xử trí liều ít đề nghị hóa chất chỉ phá hủy một trong số A bao gồm mặt. Bí quyết xử lý này sản xuất ra một số trong những đoạn ADN bao gồm chiều dài khác nhau phản ánh vị trí của A đã bị phá diệt theo trình từ bỏ chuỗi.

- bước 2: những đoạn ADN này được năng lượng điện di bên trên gel, được phạt hiện bằng tự chụp hình phóng xạ: chỉ những

đoạn ADN đã được đánh dấu 32P ở đầu 5" new được biểu hiện rõ trên gel, kích thước của chúng thể hiện khoảng phương pháp từ đầu đánh dấu đến địa chỉ A đề nghị xác định.

- bước 3: nhằm xác xác định trí của toàn bộ các Nu trong phân tử ADN, phương pháp xử lý như bên trên được triển khai đồng thời với 4 ống mang lại 4 nhiều loại Nu, thường thì T mang đến mẫu 1, C đến ống 2, G mang lại ống 3, cùng A cho ống 4.

- bước 4: phát âm vị trí các Nu tương tự như như cách thức enzym. địa điểm của 4 nhiều loại Nu bộc lộ bằng 4 làn băng, địa điểm được đọc từ bên dưới lên vì các đoạn nhỏ khi năng lượng điện di chạy nhanh hơn những đoạn có size lớn.

4. ENZYM GIỚI HẠN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ENZYM GIỚI HẠN

4.1. Enzym giới hạn (Restriction enzyme)

Enzym số lượng giới hạn hay có cách gọi khác là enzym giảm bớt có điểm lưu ý là giảm ADN ở các vị trí xác định. Cho đến thời điểm bây giờ người ta đã biết khoảng tầm trên 500 loại enzym giới hạn. Những loại enzym số lượng giới hạn có các đặc điểm sau:

- những loại enzym giới hạn đều được chiết tách từ vi khuẩn. Thương hiệu của enzym số lượng giới hạn mang tên viết tắt của vi khuẩn (xem bảng 3.1).

- giảm phân tử ADN xoắn kép ở những vị trí khẳng định cho từng loại enzym giới hạn.

- địa điểm cắt thông thường có 4 - 8 Nu, đặc trưng đặc biệt quan trọng nhất của trình tự phân biệt là đoạn ADN có 4 đến 8 cặp Nu này có trình tự như là nhau khi hiểu theo chiều 5’ - 3’. Vì vậy vị trí giảm của enzym như thể nhau bên trên 2 mạch (xem vị trí cắt ở bảng 3.1).

- sau khoản thời gian bị giảm ADN có các đầu kết dán ở những sợi đơn. Cùng bị giảm với cùng một số loại enzym giới hạn, những phân tử ADN có các đầu kết dính với những Nu bổ sung cập nhật cho nhau.

4.2. Tính năng của enzym giới hạn

Enzym giới hạn ở vi khuẩn có mục đích phân giải ADN của virus lúc virus xâm nhập vào vi khuẩn. Trong vi trùng có enzym biến đổi đế methyl hóa enzym giới hạn tạo nên enzym số lượng giới hạn mất hoạt tính, không ảnh hưởng tác động đến ADN của vi khuẩn.

Chức năng giảm của enzym giới hạn đã tạo nên phân tử ADN dài gồm thế bị giảm ra từng đoạn đế phân tích. Sau khi bị cắt, những đoạn ADN gồm thế được điện di bên trên agarose gel đế xác định tính chất, hoặc sử dụng đế khiến cho các phân tử ADN lai.

5. LAI ACID NUCLEIC

5.1. ADN dò (DNA probes)

Trước khi thực hiện các nghệ thuật lai acid nucleic tín đồ ta phải tạo ra các ADN dò.

ADN dò là một trong đoạn ADN sợi đối chọi mà trình từ bỏ Nu, đặc điểm của bọn chúng đã được biết. Một vài loại ADN dò đang được chào bán tại thị trường. Có tên như vậy do ADN dò có công dụng dò tìm hồ hết đoạn ADN gai đơn tương ứng trên các phân tử ADN cần phải phân tích, ví dụ các đoạn ADN phi lý trong một vài bệnh đề xuất chẩn đoán.

Phương pháp chế tạo ra ADN dò:

- phương thức sao mã ngược:

- phương thức tổng vừa lòng từ những Nu theo một trình tự đã biết.

- Phương pháp tách bóc chiết trường đoản cú ADN của bộ gen.

Trong phương pháp lai acid nucleic có cách thức sử dụng cách thức lai các alen với những mẫu dò đặc hiệu (allele specific oligonucleotide), phương pháp thường cần sử dụng với các kỹ thuật sau

5.2. Các phương pháp lai acid nucleic

5.2.1. Phương pháp Southern blotting

Kỹ thuật này được Southern phát hiện ra vào năm 1975.

Mục đích của kỹ thuật: dò tra cứu một phân tử ADN vào số không hề ít phân tử ADN. Đây là một phương thức đã được dùng làm phát hiện nay bệnh ở tầm mức độ phân tử. Southern blotting cũng khá được dùng trong nhiều kỹ thuật lai ADN khác.

Các bước cơ phiên bản của kỹ thuật:

Tách phân tách ADN từ các mẫu thứ như bạch cầu, tự tế bào nước ối, tế bào làm việc tua rau thai...

- Phân tử ADN được cắt bởi enzym giới hạn tạo cho những đoạn ADN có size khác nhau, trong số này rất có thể có đoạn sở hữu gen cần tìm.

- Điện di các đoạn ADN trên agarose gel: tùy theo size của đoạn ADN mà có các băng năng lượng điện di ở các vị trí khác nhau.

- Để gel tiếp xúc với NaOH, NaOH làm biến đổi tính ADN thành sợi đối kháng (cắt những cầu nối hydro. Rất có thể dùng ánh nắng mặt trời cao làm vươn lên là tính ADN.

- sau khi tráng gel được để lên giấy thấm, giấy thấm gồm tiếp xúc cùng với dung dịch điện di, giấy nitrocellulose được khóa lên trên gel. Dùng một đồ gia dụng nặng nghiền lên trên giấy tờ thấm, ADN đã thấm tự gel lên giấy nitrocellulose.

- Sau cùng, giấy nitrocellulose sẽ thấm ADN được cho vào trong bình lai đã tất cả ADN dò. Nếu như phân tử ADN sợi đối chọi mang gen khớp ứng với ADN dò sẽ có sự phối kết hợp ADN sợi 1-1 với sợi solo của ADN dò tạo nên phân tử lai theo nguyên tắc bổ sung của những cặp Nu. Trên giấy nitrocellulose vẫn hiện băng vì chưng sự phối hợp ADN dò với ADN đích. Băng này có thể nhìn thấy khi dùng tự chụp ảnh phóng xạ hoặc dùng hóa chất.

Xem thêm: Trẻ 5 Tháng Có Ăn Được Váng Sữa Và Bột Không? Trẻ Mấy Tháng Ăn Được Váng Sữa

5.2.2. Phương thức Northern blotting

Khác với phương pháp Southern blotting, acid nucleic đích ở đấy là ARN chứ không hẳn ADN. Phát hiện ARN bằng phương pháp lai cùng với cADN đã lưu lại cho đề xuất kỹ thuật này được hotline là Northern blotting.

5.2.3. Cách thức Dot blotting - Slot blotting

Lai theo phương pháp dot-blot là cách thức sàng lọc cấp tốc thường triển khai với đầy đủ mẫu dò ASO (allele-specific oligonucleotide) để riêng biệt sự khác biệt giữa các alen ở đoạn một Nu. Cách thức này không cần điện di trên thạch mà bằng thấm trực tiếp từ kia để xác minh những đoạn Nu khác nhau.

Quy trình tiến hành của chuyên môn qua các bước sau:

- cách 1: hỗn hợp ADN đích được thay đổi tính bằng ánh sáng hay bằng dung dịch kali để bóc tách ADN tua kép thành ADN sợi đơn.

- bước 2: gắn thêm ADN đích đã được biến tính lên màng lai (màng nitrocellulose hoặc màng nylon).

- cách 3: đưa màng lai đựng ADN đích vào dung dịch cất ADN dò.

- bước 4: sau khoảng tầm 20 - 24 tiếng ADN dò sẽ đã tích hợp ADN đích chế tạo thành chuỗi kép.

- cách 5: cọ màng lai, nhằm khô trường đoản cú nhiên tiếp đến phân tích bởi tự chụp ảnh phóng xạ.

Ngoài ra còn rất có thể gắn ADN dò lên màng lai, còn ADN đích được để tại trong hỗn hợp và công việc tương trường đoản cú như trên.

Phương pháp này áp dụng để biệt lập giữa những alen khác nhau thậm chí bởi một vài Nu. Với mục đích này người ta đã tạo nên những đầu dò ASO từ phần đa chuỗi Nu có kích thước khác nhau. Hồ hết đầu dò ASO này thường chỉ gồm từ 15 - 20 Nu và thông thường được hoạt động dưới những đk lai, ở đó ADN kép được tạo nên do sự kết hợp giữa dò và đích giả dụ base bổ sung giữa dò với đích là tương hợp. Nếu bao gồm sự không tương xứng (chỉ phải một nối lệch) thân ADN dò với đích thì làm cho chuỗi xoắn kép không bền vững. Bằng cách tăng nhiệt độ tối đa có thể phát hiện phần đa chỗ nối lệch này. Mặc dù ASO có thể đã sử dụng cách thức lai Southern blot, nhưng mà ASO được sử dụng dễ ợt hơn một trong những thực nghiệm dot-blot.

Nhìn tầm thường kỹ thuật của dot-blot bao hàm lấy được hỗn hợp ADN đích (có thể là cục bộ gen của người), nhưng đơn giản dễ dàng hơn là thu được gần như vết ADN sinh hoạt trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon.

Cần biệt lập kỹ thuật slot-blot cùng dot-blot. Nhị kỹ thuật này khác nhau ở các vết ADN thu được. Đối cùng với dot-blot thì ADN thu được nằm ở trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon dạng dấu tròn, còn slot-blot thì ADN thu được nằm tại những rãnh mà họ đã khía trước bên trên màng nitrocellulose hoặc màng nylon.

5.2.4. Chuyên môn lai tại khu vực huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization: FISH)

Cuối năm 1980, nghệ thuật FISH được ứng dụng thoáng rộng để phân phát hiện các bất thường xuyên NST. Đây là kỹ thuật quan trọng đặc biệt có ý nghĩa trong chẩn dự đoán sinh bởi nó rất có thể thực hiện trên nhân tế bào gian kỳ không phải qua thời hạn nuôi cấy. Bởi vì vậy, sau 24 - 48 giờ đã gồm kết quả. Chủng loại tế bào hoàn toàn có thể lấy sớm tự tuần 12 (số lượng mẫu dịch ối 2 - 5 ml).

Kỹ thuật FISH là 1 trong kỹ thuật di truyền tế bào - phân tử sử dụng trình từ chuỗi ngắn ADN sợi đối chọi (ADN dò), các ADN dò sẽ được lai cùng với ADN đích bên trên tiêu phiên bản NST ở kỳ giữa hoặc gian kỳ. Dưới kính hiển vi huỳnh quang ta rất có thể phát hiện, định vị những khu vực ADN dò lai cùng với ADN đích. Dựa vào vậy, phát hiện nay được hồ hết rối loạn số lượng và kết cấu NST.

Có những loại ADN dò cơ bản sau:

- ADN dò phần tâm: các loại ADN dò này đa số sử dụng nhằm phát hiện các bất thường con số NST và phát hiện những NST những tâm, đa số mảnh ko tâm.

- ADN dò đặc hiệu locus lai từng vùng của một NST: các loại ADN dò đa số phát hiện những đột thay đổi gen - những rối loạn kết cấu NST như: nhân đoạn nhỏ, mất đoạn nhỏ dại v.v... Mà phương pháp nhuộm băng ko phát hiện được.

- ADN dò tổng thể NST: dùng hầu hết ADN dò lai dọc từ chiều nhiều năm của một NST. Điều này được cho phép phân biệt những NST khác biệt dựa vào màu sắc của chúng. Phương pháp này chủ yếu phát hiện náo loạn số lượng, cấu trúc NST ví dụ phát hiện tại khi 1 phần của NST này gắn thêm một phần NST khác trong ngôi trường hợp đưa đoạn.

- ngoài ra, còn tồn tại kỹ thuật mBand FISH (multicolor fluorescence in situ hybridization) để phát hiện các bất thường xuyên trên các vị trí băng NST.

- Ứng dụng chuyên môn FISH trong chẩn dự báo sinh hội hội chứng Down: áp dụng ADN dò NST 21; ví như nhân tế bào gian kỳ bao gồm 2 biểu đạt lai → 2 NST 21; nếu bao gồm 3 biểu thị lai → 3 NST 21.

5.2.5. Lai ADN trong công nghệ sinh học tập - tạo gen đơn dòng

Mục đích kỹ thuật: đưa phần lớn đoạn ADN (gen) quan trọng vào, đào thải những đoạn ADN ăn hại để làm cho những phân tử ADN lai nguyên tắc tổng hòa hợp nên thành phầm (chế phẩm) có chất lượng cao, với con số nhiều hơn, thời hạn sản xuất ngắn hơn.

Để tiến hành được chuyên môn này cần: phân tử ADN mang lại (có quality tốt), phân tử ADN nhận (có kĩ năng nhân lên nhanh). Các bước cơ bản của nghệ thuật này bao gồm:

- chọn ADN mang đến và ADN nhấn hay nói một cách khác là vector (thể truyền). Vector thường được dùng là những plasmid của vi khuẩn, những phage, đôi khi người ta còn dùng các cosmid.

- dùng enzym giới hạn tương đồng để cắt ADN cho và ADN của vector.

- dùng enzym nối (ligase) để nối đoạn ADN mang lại và phân tử ADN vector để sinh sản phân tử lai.

- vào trường hợp ý muốn đưa phân tử ADN lai vào vi khuẩn, lấy ví dụ vào E. Coli, bạn ta sử dụng CaCl2 để tạo điều kiện cho phân tử lai đột nhập vào vi khuẩn thuận tiện hơn. Các phân tử ADN được chuyển vào vi trùng sẽ nhân lên, trong những số ấy có những phân tử lai, nhưng cũng có thể có những phân tử chưa nhận ADN cho vì chưng vậy cần phân lập riêng phân tử lai, ví dụ như trong trường hợp vi trùng kháng kháng sinh, có vi khuẩn vẫn mọc trong môi trường kháng sinh (chưa nhận phân tử mang lại mang tính cảm ứng với chống sinh), có vi trùng không mọc đựơc trong môi trường thiên nhiên đó do đoạn ADN mang tính chất chất chống kháng sinh đã có được thay bằng đoạn ADN chạm màn hình với kháng sinh.

- Bằng cách thức vi sinh vật học, bạn ta cấy truyền những khuẩn lạc mang tính chất chất đề xuất nghiên cứu.

- người ta cũng còn dùng phương pháp chuyển các khuẩn lạc từ bỏ đĩa cấy petri lịch sự giấy thấm, sau đó cho lai với ADN dò sau thời điểm đã làm phát triển thành tính ADN đích, hiệu quả lai được reviews bằng tự chụp hình phóng xạ để phát hiện tại khuẩn lạc đề nghị tìm.

- Sự nhân lên những lần một một số loại khuẩn lạc mang phân tử ADN đích nào đó trong vi trùng gọi là tạo cái invivo.

6. HIỆN TƯỢNG ĐA HÌNH VỀ CHIỀU DÀI CỦA CÁC ĐOẠN và DO ENZYM GIỚI HẠN TẠO NÊN (Restriction fragment length polymorphisms: RFLP)

Khi đã gồm ADN dò mang lại một dịch nào kia thì bài toán chẩn đoán bệnh dịch đó có thể thực hiện bằng phương pháp

Southern blotting như vẫn nêu sống trên. Nhưng mà thực tế, số ADN dò vẫn biết còn siêu ít. Trong trường hợp không biết ADN dò, nhằm chẩn đoán bệnh bạn ta hoàn toàn có thể dùng một phương pháp gián tiếp, kia là cách thức dùng các biến đổi tự nhiên của ADN hay có cách gọi khác là RFLP. Vậy RFLP là gì?

RFLP là hiện tượng lạ đa hình về chiều dài của các đoạn ADN vì enzym số lượng giới hạn tạo nên.

Người ta cầu tính chỉ tầm 10% ADN của người tham gia vào tổng phù hợp protein, phần còn lại có công dụng chưa được rõ. Ở mọi đoạn ADN không tham gia tổng phù hợp protein, có thể có những biến đổi của những base tuy thế không ảnh hưởng đến vẻ bên ngoài hình. Mặc dù những sự đổi khác như vậy có thể được xác định vì chúng làm biến đổi đoạn do enzym giới hạn tạo nên, làm biến hóa số lượng, chiều dài đoạn được cắt. Ví dụ: trên phân tử ADN tất cả 3 địa chỉ cắt, bởi vậy 2 đoạn ADN được tạo thành, tuy vậy nếu bao gồm 2 vị trí giảm thì chỉ có một đoạn giảm được chế tạo ra thành. Hầu như sự đổi khác của những đoạn như vậy rất có thể được dấn diện bằng phương thức điện di. Sự dìm diện những đoạn này dựa vào vào ADN dò được dùng, và dựa vào vào địa điểm ADN dò được dùng. Nếu gene đích (ví dụ ren bệnh) link với địa chỉ của RFLP, có nghĩa là gen và vị trí RFLP ngơi nghỉ trên cùng một NST và ở sát nhau tạo nên một tái tổ hợp di truyền trong quá trình giảm phân. Sự phân tích các ADN tái tổ hợp trong gia đình cho phép chẩn đoán hình trạng gen. Vì vậy RFLP được dùng như một vệt ấn (marker) trong chẩn đoán dịch trước sinh hoặc sau sinh ngay lập tức từ khi chưa có thể hiện bệnh. RFLP cũng được dùng nhằm phân biệt khung hình đồng hợp hay cơ thể dị hợp. Kan với Dozy là những người thứ nhất dùng RFLP nhằm chẩn đoán. Các tác giả đã chứng minh rằng trong gia đình có bệnh hồng ước liềm (HbS) enzym giảm Hpa I đã giảm ADN và tạo nên các đoạn có size khác nhau, một đoạn phân ly với gen lành, đoạn không giống phân ly với ren HbS. Kỹ năng này được sử dụng cho chẩn dự đoán sinh.

Hiện tượng nhiều hình chiều dài của các đoạn bởi enzym giới hạn được dt theo quy khí cụ Mendel.

RFLP là một phương pháp được dùng làm lập bản đồ gen.

7. DẤU ẤN ADN (DNA Fingerprinting)

- mục tiêu của kỹ thuật: nghệ thuật này nhằm phân biệt được tín đồ này với những người khác, cá thể cùng loài phụ thuộc vào sự có mặt và phân bố của những vạch ADN y hệt như khi sử dụng dấu vân da bàn tay.

- nguyên tắc của kỹ thuật: một vệt ấn ADN mang tên là VNTR (variable number of tandem repeats) hay nói một cách khác là microsatellite, có 11 cho tới 60 song base, vệt ấn này có mặt nhắc đi đề cập lại những lần trong cỗ gen. Sự có mặt của đoạn ADN lốt ấn này đặc thù cho từng cá thể.

- số lần nhắc lại của dấu ấn này hoàn toàn có thể khác nhau vào từng locus và những dấu ấn ADN tương đương nhau có thể gặp ở phần đông vị trí không giống nhau của cỗ gen. Nếu locus gen phía trong phạm vi của đoạn bị cắt vì chưng enzym giới hạn thì chiều dài của đoạn cắt chuyển đổi tùy theo mốc giới hạn nhắc lại của VNTR.

- Tính đa hình vì VNTR rất đặc trưng cho yêu cầu kỹ thuật này đang được áp dụng trong việc xác định phụ hệ và trong y pháp.

- Kỹ thuật nhằm phát hiện nay VNTR: cũng bao gồm các bước như khi tiến hành Southern blotting đến cách chuyển VNTR lịch sự giấy nitrocellulose nhưng sau đó lai ADN đích cùng với ADN dò nhằm phát hiện phân tử lai. Ngày nay, sau thời điểm phát hiện ra kỹ thuật PCR fan ta rất có thể phát hiện trực tiếp các VNTR với những đôi mồi sệt hiệu.

Một số trang thiết bị cơ bản cho phòng xem sét phân tử

Để ứng dụng một số trong những kỹ thuật sinh học tập phân tử áp dụng trong y học tập như bóc tách chiết ADN - PCR.

1. Trang thứ cơ bản

- đồ vật ly tâm thường thì trong phòng phân tách với ống ly trung tâm (5 - 100ml) hoặc ly trung tâm ống nhỏ tuổi (0,5 - 2 pl). Trang bị ly vai trung phong lạnh.

- Tủ ấm, bình biện pháp thủy (tốt duy nhất là bình có lắc).

- Tủ rét mướt từ 4oC đến -20oC hoặc -80oC: tùy mức độ bảo quản mẫu, bao gồm thể bảo quản ADN vào nitơ lỏng với thời hạn dài hàng chục năm.

- Tủ ấm 37oC, thứ đo pH, sản phẩm công nghệ lắc, vật dụng sấy khô, thứ hấp độ ẩm (tiệt trùng), tủ sấy với nhiệt độ cao, cân nặng (có thể cân nặng được g, mg).

- Micropipet những loại: 0,5 - 100pl; đôi mươi - 100pl; 200 - 1000pl, những loại đầu týp cho micropipet.

- Ồng Eppendort, các loại ống đong, các loại pháp luật thông thường ở trong phòng xét nghiệm sinh hóa như chai, cốc..., giấy thiếc, giấy chỉ thị màu.

2. Hóa chất

- Hóa chất dùng để tách ADN - ARN

- chất hóa học pha các dung dịch đệm

Tham khảo thực tập di truyền Y học bài “Một số chuyên môn sinh học phân tử thông dụng vận dụng trong Y học”.

3. đầy đủ máy thông dụng

- vật dụng soi tử ngoại.

- Máy năng lượng điện di.

- thứ PCR.

TỰ LƯỢNG GIÁ

1. Trình bày phương pháp bóc tách chiết ADN và phương pháp điện di ADN.

2. Trình bày điểm lưu ý và chức năng của enzym giới hạn (enzym hạn chế).

3. Trình bày nguyên tắc và các phương thức xác định trình từ nucleotid trong phân tử ADN.

4. Nêu đặc điểm của ADN dò, phương pháp tạo ADN dò.

5. Trình bày kỹ thuật Southern Blotting.

6. Trình diễn kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction): phản bội ứng chuỗi polymerase.

7. Nêu hiện tượng kỳ lạ đa hình về chiều dài của các đoạn ADN bởi vì enzym giới hạn khiến cho (RFLP).

Ebook dt Y học - cỗ Y Tế

LƯỢC SỬ - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI DI TRUYỀN ĐA gen VÀ DI TRUYỀN ĐA NHÂN TỐ Ở NGƯỜI BẤT THƯỜNG BẨM SINH DI TRUYỀN UNG THƯ DI TRUYỀN HỌC QUẦN THỂ NGƯỜI TƯ VẤN DI TRUYỀN NHIỄM SẮC THỂ CỦA NGƯỜI BỆNH HỌC NHIỄM SẮC THỂ MỘT SỐ KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ ỨNG DỤNG trong Y HỌC BỘ ren CỦA NGƯỜI DI TRUYỀN PHÂN TỬ CỦA CÁC BỆNH Ở NGƯỜI BỆNH RỐI LOẠN CHUYỂN HÓA BẨM SINH DI TRUYỀN ĐƠN ren DI TRUYỀN NHÓM MÁU - CƠ SỞ DI TRUYỀN CỦA HỆ THỐNG KHÁNG NGUYÊN BẠCH CẦU NGƯỜI